Papel do colesterol exógeno nos mecanismos de adaptação de Leishmania spp a condições de estresse metabólico e farmacológico / Role of exogenous cholesterol in Leishmania spp adaptation mechanisms to conditions of metabolic and pharmacological stress

Os tripanossomatídeos não sintetizam o colesterol e sim esteróis com o esqueleto ergostano, porém um percentual significativo de colesterol exógeno é encontrado em todas as espécies de Leishmania, sugerindo um papel biológico para esta molécula. Esta tese tem como objetivo estudar a importância do uso de colesterol para Leishmania spp. em várias situações, avaliando o potencial deste sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores de biossíntese de ergosterol associado com inibidores de transporte de colesterol derivado de LDL, foi avaliada em promastigotas e amastigotas intracelulares. A associação entre LBqT01 e cetoconazol, miconazol ou terbinafina mostrou sinergia. A associação entre a imipramina ou progesterona e cetoconazol ou terbinafina indicaram um efeito aditivo. O cetoconazol e miconazol demonstraram uma diminuição de até duas vezes o valor de IC50 nas formas amastigotas, quando combinado com os inibidores de transporte de colesterol. Foi observado também alteração da biossíntese de ergosterol após tratamento dos parasitos com os inibidores de transporte de colesterol, demonstrado por CG/MS. A combinação de LBqT01 e cetoconazol mostrou ser mais ativa in vivo do que cada fármaco individualmente. Estudamos também o mecanismo de resistência desses inibidores, avaliando a modulação de enzimas da via de biossíntese de esteróis e a utilização de colesterol exógeno pelos parasitos. Promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis foram cultivadas com concentrações crescentes de sinvastatina, terbinafina e miconazol. Estes inibidores mostraram um índice de resistência de 2,5 - 8 vezes. A resistência cruzada também foi avaliada, com estes inibidores e fármacos de referência (miltefosina, anfotericina B e antimônio trivalente)...

The trypanosomes do not synthesize cholesterol sterols but with ergostane skeleton, buta significant percentage of exogenous cholesterol is found in all species of Leishmania,suggesting a biological role for this molecule. This work aims to study the importanceof use cholesterol to Leishmania spp. in several cases, evaluating the potential of thesystem as a possible drug target. The activity of the inhibitors of ergosterol biosynthesisinhibitors associated with transport of LDL cholesterol derivative was evaluated inintracellular amastigotes and promastigotes. The association between LBqT01 andketoconazole, miconazole or terbinafine showed synergy. The association betweenimipramine or progesterone, and ketoconazole, or terbinafine indicated an additiveeffect. The ketoconazole and miconazole showed a reduction of up to twice the IC50value in amastigotes when combined with the inhibitors of cholesterol transport. Changeof ergosterol biosynthesis of parasites after treatment with inhibitors of cholesteroltransport as demonstrated by GC/MS was also observed. The combination of LBqT01and ketoconazole was more active in vivo than either drug individually. We also studiedthe mechanism of resistance of these inhibitors by evaluating the modulation ofenzymes of the sterol biosynthesis pathway and use of exogenous cholesterol byparasites. Promastigotes of Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis andLeishmania guyanensis were cultured with increasing concentrations of simvastatin,terbinafine and miconazole. These inhibitors showed resistance index from 2.5 to 8times. Cross-resistance was evaluated with these inhibitors and reference drugs(miltefosine, amphotericin B and trivalent antimony)...

The stepwise selection for ketoconazole resistance induces upregulation of C14-demethylase (CYP51) in Leishmania amazonensis

Ketoconazole is a clinically safe antifungal agent that also inhibits the growth of Leishmania spp. A study was undertaken to determine whether Leishmania parasites are prone to becoming resistant to ketoconazole by upregulating C14-demethylase after stepwise pharmacological pressure. Leishmania amazonensis promastigotes [inhibitory concentration (IC)50 = 2 µM] were subjected to stepwise selection with ketoconazole and two resistant lines were obtained, La8 (IC50 = 8 µM) and La10 (IC50 = 10 µM). As a result, we found that the resistance level was directly proportional to the C14-demethylase mRNA expression level; we also observed that expression levels were six and 12 times higher in La8 and La10, respectively. This is the first demonstration that L. amazonensis can up-regulate C14-demethylase in response to drug pressure and this report contributes to the understanding of the mechanisms of parasite resistance.

Avaliação da utilização de colesterol exógeno por Leishmania amazonensis como possível alvo farmacológico / Evaluation of the use of exogenous cholesterol by Leishmania amazonensis as possible pharmacological target

Todos os fármacos atualmente em uso para o tratamento da leishmaniose apresentam restrições, como toxicidade, graves efeitos colaterais, custo elevado, administração parenteral ou teratogenicidade. Desta forma, o desenvolvimento de fármacos mais eficazes e seletivos é de suma importância e a identificação de vias metabólicas exclusivas do parasito que possam ser usadas como alvo pode ser um ponto de partida interessante. Acredita-se que a leishmania não dependa da utilização do colesterol exógeno para sua sobrevivência, uma vez que sintetiza seus próprios esteróis. Porém, apesar disso, um percentual expressivo de colesterol é encontrado em suas membranas sendo, em alguns casos, o esterol majoritário indicando um papel biológico para essa molécula. O presente trabalho visa estudar a importância para a L. amazonensis da utilização do colesterol proveniente do soro, em diversas situações, avaliando o potencial desse sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores da biossíntese do ergosterol (cetoconazol, miconazol, terbinafina e sinvastatina) foi avaliada, na presença de soro normal ou deslipidado. Foi observada que a privação das lipoproteínas do soro potencializa o efeito dos inibidores do ergosterol. Os promastigotas tratados com esses inibidores mostraram diferenças na sua composição lipídica, com acúmulo de colesterol nas células tratadas, principalmente, com cetoconazol e miconazol, indicando um possível mecanismo de compensação da leishmania, para suprir a inibição do ergosterol. Experimentos com LDL-I125, no qual tanto a leishmania tratada com cetoconazol, quanto a tratada com sinvastatina, que inibe o início da via de biossíntese de ergosterol, aumentaram a captação da LDL. A suramina, um inibidor da captação de LDL, mostrou uma diminuição do conteúdo de colesterol da leishmania e, em associação com a sinvastatina, obteve um efeito sinérgico, mostrando que o conteúdo da LDL, principalmente colesterol, pode estar envolvido na manutenção da integridade da membrana da célula. Em adição, a resistência ao cetoconazol induzida in vitro foi estudada. Foi observada uma relação direta entre o aumento da expressão gênica da C14-desmetilase com o nível de resistência induzido em promastigotas de L. amazonensis, sugerindo que esse seja o principal mecanismo de resistência a essa classe de fármacos. De uma maneira geral, a análise dos resultados como um todo sugere que o colesterol desempenhe um importante papel na atividade dos inibidores da biossíntese do ergosterol e que o bloqueio da sua utilização pode ser um possível alvo farmacológico.